摘要：皮膚損傷愈合過程包括炎癥期、增生期、組織重建期111，在這期間，中性粒細胞、單核細胞、成纖維細胞是重要的參與細胞，中性粒細胞、單核細胞發揮的是清除異物及壞死物質的作用．而成纖維細胞發揮的是組織修復作用。研究表明，內源性大麻素(endo．cannabinoid．EC)系統能夠參與許多生理功能調節，包括內源性大麻素、大麻素受體及合成與降解內源性大麻素的酶等【瓠。其中的大麻素I型受體(cannabi．noid receptor 1，CBlR)主要分布于中樞神經系統神經元突觸前膜的G蛋白偶聯受體(G proteincoupledreceptor，GPCR)，又稱中樞性CBlR。Zheng等[31對紫外線引起的皮膚炎癥及腫瘤的研究發現，紫外線輻射能直接激活CBlR。本研究應用免疫組織化學和Western印跡法研究在小鼠皮膚切創愈合過程中CBlR的定位表達及隨時間的表達變化，為進一步研究CBlR的作用機制奠定基礎。
關鍵詞：法醫病理醫學；傷口愈合；皮膚；受體，大麻酚，CBl；小鼠
目的探討小鼠皮膚切創愈合過程中損傷區大麻素I型受體(cannabinoid receptor I，CBlR)的表達及不同時間的變化規律。方法應用免疫組織化學和Westem印跡法檢測小鼠皮膚切創后不同時間段CBlR的變化情況。結果正常組織中有少量CBlR的表達，位于表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌層。傷后6～12h。中性粒細胞不表達CBlR，傷后1～5d，陽性染色以單核細胞和成纖維細胞為主。傷后7～14d，CBlR陽性著色以成纖維細胞為主。陽性細胞率6h一3d逐漸升高，5d達到高峰，7～14d逐漸降低。經Western印跡法顯示各個時間段均有CBlR的陽性條帶，其中5 d為CBlR表達的高峰。結論在皮膚損傷愈合過程中CBlR被激活。CBlR表達于單核細胞，可能參與炎癥反應。CBlR在損傷周邊區表達于成纖維細胞，可能參與皮膚損傷后的愈合。其變化規律可用于損傷時間的推斷。
1 材料與方法
1．1材料
1．1．1主要試劑兔抗小鼠CBlR多克隆抗體(ab23703，英國Abcam公司)，兔SP檢測試劑盒(sP一9001，北京中杉金橋生物技術有限公司)，6條帶預染Marker(立陶宛Fermentas公司)。組織／細胞裂解液(H10200，遼寧華特生生物技術有限公司)，蛋白酶抑制劑(H10210，遼寧華特生生物技術有限公司)，小鼠抗GAPDH單克隆抗體(加拿大SignalChem公司)，山羊抗兔IgG(ZB一2301)、山羊抗小鼠IgG(ZB一2305)及DAB(北京中杉金橋生物技術有限公司)。
1．1．2動物模型制作及分組健康成年清潔級昆明系小鼠50只，雄性，體質量35～409。隨機分為傷后0、6、12h和1、3、5、7、lO、14d及對照組，每組5只。乙醚氣體吸入麻醉，剪毛處理，常規手術消毒，在背部中央做一縱行長1．5cm皮膚切創，深達筋膜，創面自然止血，不包扎，不施藥。切創后每只小鼠給予清潔飼料及自來水，分籠飼養，并保持創口干燥，防止創口感染。分別于傷后0、6、12h及1、3、5、7、10、14d將小鼠脫頸椎處死，取傷口處1．0cmx1．5em皮膚組織。對照組小鼠取相同部位同等大小皮膚，但不做切口。
1．2方法
1．2．1切片制備每組1／2皮膚放人4％多聚甲醛PBS溶液中固定12h后，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作5斗m厚切片。
1．2．2常規HE染色切片脫蠟，水化。蘇木素染色3min，在1％的鹽酸一乙醇中分化數秒，自來水中返藍30rain，1％伊紅染色lmin，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。
1．2．3免疫組織化學染色切片脫蠟、水化，微波抗原修復后用3％H：O：孵育，正常用非免疫山羊血清孵育，兔抗小鼠CBlR多克隆抗體(1：200)作為一抗，應用SP免疫組織化學技術進行染色．DAB顯色，蘇木素核復染。染色中以PBS代替一抗作為空白對照。Journal of Forensic Medicine，August 2010，V01．26，No．4
1．2．4 Western印跡法檢測冰浴下(4℃)將各時間段的另1／2皮膚剪碎，加入組織裂解液300斗L及蛋白酶抑制劑3斗L勻漿，機械破碎后，4qc下以離心半徑9．35 cm，12000 r／min，離心30min，提取上清液，用BCA法測量蛋白濃度，將樣本置于一80℃保存，備用。變性后，總蛋白量為40斗g。
進行12％SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白后．半干轉法將蛋白轉移到PVDF膜上。用5％的脫脂牛奶封閉2h．TTBS洗滌3次，用兔抗小鼠CBlR多克隆抗體(1：200)孵育，4℃過夜。TYBS洗滌3次后，與山羊抗兔IgG二抗(1：4000)室溫孵育2h，TI'BS洗滌3次后。與DAB反應5rain，晾干，掃描，保存。
1．2．5統計分析采用SPSS 13．0軟件包，應用方差分析對數據進行統計學處理。組間比較用t檢驗，數據應用孑拯表示，檢驗水準a--O。05。
1．3結果分析
1．3．1 HE染色結果分析CBlR陽性表達位于胞膜及胞漿．用DAB顯色呈棕黃色。顯微鏡(x400)下。在每張切片損傷及其周邊區內(距損傷區200t．Lm范圍內)隨機選擇10個視野，計算每個視野中中性粒細胞、單核細胞、成纖維細胞的總數。
1．3．2免疫組織化學染色結果分析顯微鏡(x400)下．在每張切片損傷及其周邊區內(距損傷區200t．Lm范圍內)隨機選擇10個視野，計算每個視野包括中性粒細胞、單核細胞及成纖維細胞的陽性細胞，并計算每個視野中陽性細胞與3種細胞總數的比值(陽性細胞率)。
1．3．3 Western印跡法檢測結果分析用平均灰度值(AVG)分析各時間段條帶的大小和濃淡，該系統灰度值以O表示黑，255表示白，數值越小表示量越多。
2 結果
2．1 HE染色及細胞計數
傷后6h見創緣表皮胞漿均質化，細胞核消失，真皮內中性粒細胞浸潤增多；傷后12h見皮下組織及創底有大量滲出的中性粒細胞及單核細胞；傷后1 d見大量以單核細胞為主的炎細胞浸潤；傷后3d創口結痂．肉芽組織形成。中性粒細胞明顯減少，肉芽組織向創腔內機化：傷后7d肉芽組織內見大量長梭形細胞核管腔樣結構：傷后10～14d，創口基本愈合，損傷區及損傷周邊區的中性粒細胞、單核細胞及成纖維細胞逐漸減少，間質增多，肉芽組織向瘢痕組織轉變，表皮覆蓋創口。不同時間段中性粒細胞、單核細胞及成纖維細胞的總數見。與相鄰上組比較，P<>
2．2免疫組織化學染色及陽性細胞計數
正常小鼠皮膚組織內，表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌層表達CBlR：傷后6h～1 d．CBlR主要表達于單核細胞，中性粒細胞不表達CBlR；3-5d，單核細胞逐漸增多，成纖維細胞開始出現．其陽性染色集中于單核細胞及成纖維細胞，并于5 d陽性細胞率達到高峰；7～10d，陽性細胞逐漸減少；14d，創口愈合，損傷區及損傷周邊區成纖維細胞逐漸減少，以瘢痕組織替代。
2．3 Westem印跡法檢測結果
以GAPDH(相對分子質量約為3．6x104)為內參，CBlR在對照組及實驗組均有陽性條帶，位于6．3x104處。實驗組各時問段CBlR表達強度有一定規律，對照組和Oh組僅表達微弱的CBlR。6h一3d，表達逐漸增強，5d表達最強，7～14d表達逐漸減弱。
3 討論
本研究中的Western印跡法檢測結果與免疫組織化學的變化規律基本一致．體現出損傷后各時間段皮膚CBIR的含量變化。傷后5d是CBlR的含量高峰期，其他各組的平均灰度值有所不同。值得指出的是傷后714d。蛋白表達減少還可能與內源性大麻素的增加有關。GarciaGonzalez等【141研究發現，成纖維細胞暴露于一定劑量的CBlR激動劑24h后，去掉激動劑．CBlR蛋白的表達在72h內出現降低。并指出激動劑誘導CBlR蛋白表達被抑制。這可能也與GPCR的調節有關，有人研究激動劑能導致轉染了的細胞系中．CBIR快速磷酸化并發生內吞【b一司，而且在激動劑連續存在的情況下。受體會被溶酶體降解，從而及時中止GPCR引起的下游信號通路放大作用。
經免疫組化和Western印跡法檢測分析，CBlR在炎癥期可能發揮促進炎癥反應，在增生期可能發揮促進纖維化的作用，而CB2R在一些疾病的研究中有抗炎和抗纖維化的作用。并且已有研究證實在小鼠實驗性真皮纖維化模型中激活CB2R能限制白細胞的聚集和真皮的纖維化舊。所以推斷在皮膚損傷愈合過程中。EC系統中的兩個受體在炎癥期和增生期可能起到互補的作用。本實驗中．激活CBlR的內源性大麻素和參與的酶尚待進一步研究，在皮膚切創愈合過程中CBlR參與的信號通路同樣需要探討，如果在研究中引入CBlR拮抗劑(SRl41716)、基因敲除、RTPCR等方法，則能更好地闡述CBlR對皮膚損傷愈合的機制。轉載自『壹佰醫學論文網』
內源性大麻素系統包括大麻素受體、內源性大麻素及合成與降解內源性大麻素的酶。兩種大麻素受體，分別是CBlR和CB2R．CBIR主要分布于中樞神經系統．CB2R主要分布于免疫系統。CBlR除了參與中樞神經系統疾病如癲癇外，還參與能量代謝類疾病如糖尿病、肥胖、動脈粥樣硬化及肝纖維化、多發性硬化等結締組織疾病。
本研究通過免疫組織化學染色證明，小鼠正常皮膚的表皮、毛囊、皮脂腺有CBlR陽性著色，這可能與維持皮膚穩態有關。小鼠正常皮膚的皮肌層有CBlR陽性著色。已有研究證實CBlR表達于人和嚙齒類動物的骨骼肌141。并參與調節糖和脂質代謝[51。皮膚損傷修復過程中。只有單核細胞、成纖維細胞CBlR有陽性著色．中性粒細胞沒有CBlR陽性著色，這可能與大麻素受體在白細胞的表達差異有關。有研究表明，白細胞中CBlR的轉錄水平為CB2R轉錄水平的1／10～1／100【q。傷后1。5d。陽性細胞率逐漸升高，提示CBlR可能參與在皮膚損傷后單核細胞對壞死組織和炎細胞的清除過程。Sugamura等同研究人的動脈粥樣硬化斑塊發現，巨噬細胞表達CBlR。而且人外周血單核細胞在向巨噬細胞分化的過程中，CBlR表達逐漸增強。張建軍等JgJ發現在小鼠皮膚切創后l一5d，p-p38MAPK表達于單核細胞，并于3d達到高峰。而Han等191對動脈粥樣硬化的研究中進一步發現．大麻素誘導的人巨噬細胞活性氧簇的產生是有CBlR參與的，巨噬細胞上的CBlR能誘導下游的p38MAPK的磷酸化，p38被激活后能調節活性氧簇的產生和隨后的TNFQ和MCP一1的合成。CBlR通過活性氧簇的生成增加促進巨噬細胞的促炎反應。因此單核細胞CBlR的表達增強可能參與并促進炎癥反應。同為位于巨噬細胞上的大麻素受體，CB2R在很多疾病如動脈粥樣硬化、炎癥性腸病抑制炎細胞的增殖、炎癥因子的分泌。發揮抗炎的作用。傷后3d和5d陽性細胞率都相對較高，但是5d最高。3d時以單核細胞為主，并殘存少量中性粒細胞，成纖維細胞剛開始出現。而在5d時是成纖維細胞和單核細胞重疊高峰，陽性細胞占細胞總數的比例增加。CBlR表達于成纖維細胞上，提示CBlR可能參與了皮膚損傷的愈合過程。研究表明，成纖維Journal of Forensic Medicine，August 2010，V01．26，No．4細胞在炎癥介質刺激下CBlR表達增加．并沿細胞長軸伸長【1q。另外，TeixeiraClerc等111I發現人的肝硬化標本中CBlR表達增加，主要表達于在慢性肝損傷過程中轉化為肌成纖維細胞的肝星形細胞。用四氯化碳制造的急性肝硬化損傷修復模型中，選擇性CBlR拮抗劑或使用CBlR敲除小鼠能降低小鼠纖維化程度。纖維化程度降低伴隨著肝TGF一13表達降低以及肝肌成纖維細胞的生長抑制和凋亡增加。這種效應可能與蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)和細胞外信號調節激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)的磷酸化程度降低有關。因而影響了細胞的增生和生存。因此推斷CBlR參與調節肝纖維化，CBIR信號通路有促纖維化效應。Julien等【12I發現CB2R在肝纖維化的作用正好與CBlR相反，激活CB2R能產生有效的抗纖維化作用。傷后7．14d單核細胞和成纖維細胞CBlR的陽性表達強度逐漸減弱，可能與兩種細胞發生凋亡有關。Guan等13l研究證實皮膚損傷愈合過程中單核巨噬細胞及成纖維細胞均表達Fas和FasL，部分共同表達Fas和FasL的細胞發生凋亡。