目的  建立碳酸氫鹽人工腎透析液的細菌內毒素檢查方法，以控制藥品質量，防止菌血癥和熱原的發(fā)生。方法  根據中國藥典2000年版二部細菌內毒素檢查法的要求進行實驗。結果  將碳酸氫鹽人工腎透析液1∶4稀釋后，可消除干擾作用。結論  在1∶4倍的稀釋度下，可用靈敏度為0.125  Eu·mL-1的鱟試劑對樣品進行細菌內毒素檢查。
       血液透析適用于急性腎衰竭、慢性腎衰竭、急性中毒和高尿酸血癥等，特別對終末期腎衰竭患者，血透是其治療的重要手段。有報告指出，若進入人體血液的內毒 素高于每千克體重1  ng(5  EU)，除了會發(fā)冷發(fā)熱外，亦會造成低血壓、肌肉痛、惡心、嘔吐等熱原反應的各種癥狀，甚至危及生命，如敗血癥性休克或器官衰竭[1]  。為了保證產品質量和臨床使用安全，我們通過加入活性炭和用孔徑為0.3  μm的微孔濾膜過濾等措施，使配制的透析液無熱原。本試驗對碳酸氫鹽人工腎透析液進行干擾試驗，建立反應靈敏、快捷簡便的細菌內毒素檢查方法
。
1  儀器與材料

1.2.1  鱟試劑(TAL)

       TAL1：湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格為0.1  mL/支，靈敏度(λ)＝0.125  Eu·mL-1；TAL2：廣西北海制藥廠，規(guī)格為0.1  mL/支，靈敏度(λ)＝0.125  Eu·mL-1.
1.2.2  細菌內毒素檢查用水(WBET)

       湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格：2  mL/支，內毒素含量<0.0015  Eu·mL-1。
1.2.3  內毒素工作標準品(WSE)

       中國藥品生物制品檢定所，100  Eu/支，批號  。
1.2.4  碳酸氫鹽人工腎透析液

       A液,規(guī)格：5000  mL/桶，；B液,規(guī)格：7000  mL/桶.
2  實驗方法與結果

       2.1  內毒素限量

       按照《中國藥典》2000年版的規(guī)定L＝K/M，其中K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每公斤體重每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑K為5  Eu  /(kg·h);M為人用每公斤體重每小時最大劑量。按滅菌制劑的要求計算碳酸氫鹽人工腎透析液的細菌內毒素限值：M=10  mL/(kg·h)，L＝K/M=0.5  E  u·mL-1。最大稀釋倍數(shù)MVD=L/λ=0.5/0.125=4。

       2.2  鱟試劑靈敏度(λ)的復核[2]

       用WBET將細菌內毒素工作標準品溶解，置旋渦混合器上混合15  min，分別制成2.0、1.0、0.5、0.25  λ共4個濃度的內毒素標準溶液，按照中國藥典2000年版二部規(guī)定的方法操作，試驗結果見表1。表1  TAL靈敏度復核結果(略)

       按公式：λC=lg-1(ΣΧ/4)計算鱟試劑靈敏度的測定值，結果λC為0.125  Eu·ML-1。05λ<λC  <2λ，此批鱟試劑符合規(guī)定，可用于實驗。
2.3  供試品干擾試驗

       2.3.1  供試品干擾初篩試驗

       取鱟試劑和細菌內毒素工作標準品將A液進行2、4、8倍稀釋；同時將B液進行2、4、8倍稀釋,此溶液稱為NPC系列；在每一稀釋度下均制備含有2λ濃 度WSE的碳酸氫鹽人工腎透析液，此溶液稱為PPC系列。以λ＝0.125  Eu·mL-1  的TAL分別與NPC系列和PPC系列反應，并按常規(guī)設PC管和NC管各1管，結果見表2。表2  供試品干擾初篩試驗結果(略)

       表2結果表明：A液在稀釋2、4、8倍后，對細菌內毒素檢查均無影響；B液在稀釋2倍時，樣品存在干擾,只有在稀釋4倍或更大稀釋倍數(shù)時，才能消除干擾。考慮到臨床用藥安全，我們將樣品的稀釋倍數(shù)定為4倍。
2.3.2  樣品干擾試驗

       取兩批鱟試劑，按《中國藥典》2000年版二部規(guī)定的方法進行干擾試驗。A、B液各取3批樣品分別做4倍稀釋，用樣品稀釋液將細菌內毒素工作標準品稀釋 成2，1，0.5，0.25λ濃度的系列樣品內毒素溶液，即0.25，0.125，0.0625，00312  Eu·mL-1。另外用WBET作同樣稀釋試驗，試驗重復4管，同時分別以樣品稀釋液和WBET作陰性對照，此為NPC和NC管。A液反應結果見表 3，B液反應結果見表4。表3  不同TAL對供試品的干擾試驗結果(略)表4  不同TAL對供試品的干擾試驗結果(略)

       從表3可知：兩批鱟試劑的靈敏度均在0.5～2.0  λ之間，且3個批號的碳酸氫鹽人工腎透析A液測得的Et值均在0.5～2.0  Es范圍內。說明本品經4倍稀釋后，對鱟試劑和內毒素無干擾作用。

       從表4可知：兩批鱟試劑的靈敏度均在0.5～2.0  λ之間，且3個批號的碳酸氫鹽人工腎透析B液測得的Et值均在0.5～2.0  Es范圍內。說明本品經4倍稀釋后，對鱟試劑和內毒素無干擾反應。
2.3.3  供試品的細菌內毒素檢查

       碳酸氫鹽人工腎透析  A、B液各取3批樣品用WBET作4倍稀釋，使用λ＝0.125  Eu·mL-1的不同批號的TAL按中國藥典2000年版二部的方法檢查，結果樣品管和陰性管均為陰性，陽性管為陽性，樣品均未檢出細菌內毒素。

         3  討  論

       本品由A、B兩液組成，它們的處方組成如下：

       A液：氯化鈉  161.3  g,  氯化鉀  9.0  g  ，氯化鈣948  g，氯化鎂3.76  g  ，冰醋酸  11.06  g,  蒸餾水加至1000  mL。

       B液：氯化鈉  30.6  g  ，  碳酸氫鈉66  g  ，  蒸餾水加至1000  mL。

       為了使配制出來的透析液達到無熱原的要求，本法在10  000級的凈化室內配制，在配制過程中加入ω=0.2%針劑用活性炭以吸附水中及原料中的細菌、病毒和致熱原。配好的透析液用12層濾紙通過壓濾機過濾 后，再以孔徑為0.3  μm的微孔濾膜過濾，進一步將微粒、細菌、熱原等濾掉。

       在100級的環(huán)境下分裝，容器定期消毒，確保分裝的成品不受污染。這樣配制出來的透析液，經細菌內毒素檢查確認均為陰性，用熱原檢查法復核均符合規(guī)定。
         透析液，經放置5、10、15、30  d和60  d，采用靈敏度為0.125  Eu·mL-1的TAL進行細菌內毒素檢查，結果A液均為陰性，B液除放置60  d為陽性其余的均為陰性。本品B液為弱堿性溶液，容易生菌，需新鮮配制，密閉以防CO2  逸出，不宜保存太久，以防細菌生長而致菌血癥和熱原反應。為安全起見，我們將A液的有效期定為1個月，B液的有效期定為20  d。本實驗證實，碳酸氫鹽人工腎透析液4倍稀析后，采用靈敏度為0.125  Eu·mL-1的TAL對其進行細菌內毒素檢查，結果穩(wěn)定、可靠。因此，可用細菌內毒素檢查法來控制其質量。